第一篇：分子生物学教案

《分子生物学》教案

一、课程性质

必修课

二、教学目的要求

分子生物学是一门近年来发展迅速并且在生命科学领域里应用越来越广泛、影响越来越深远的一个学科。从学科角度来讲，分子生物学函盖面非常广，与生物化学和细胞生物学等生命科学主干课程有一些交叉。在学习本课程之前，要求学生已掌握了必要的数、理、化知识，并学习了植物学、动物学、微生物学与生物化学等基础课程。

通过对本课程的学习，使学生掌握基因概念在分子水平上的发展与演变、基因的分子结构和特点、基因的复制、基因表达（在转录、翻译水平）的基本原理、基因表达调控的基本模式、基因发生突变与交换及DNA遗传多型性检测的分子生物学原理，了解新兴起的基因组学和后基因组学研究现状。通过与实验课相结合，系统地介绍与基因克隆相关的DNA技术，使学生们掌握一些基本的分子生物学技术。

三、教材及有关参考书

朱玉贤等，《现代分子生物学》高等教育出版社，2002 Benjamin Lewin编著

余龙等主译，《Gene Ⅷ》科学出版社，2005 赵寿元等，《现代遗传学》高等教育出版社，2001 孙乃恩等，《分子遗传学》南京大学出版社，1990

四、适用专业

生物科学、生物技术、生物工程、科学教育等专业

五、授课学时

36学时

六、课程内容

第一章

绪论

教学目的：使学生对分子生物学的发展简史、分子生物学的研究内容及发展前景有较全面的了解。

教学重点、难点：基因概念的发展与演变；对现代遗传学各发展阶段的认识。课时安排：4学时 教学内容：

一、什么是分子生物学？

分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。

二、分子生物学的发展简史

从1847年Schleiden和Schwann提出“细胞学说”，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对生物大分子--细胞的化学组成却有了深刻的认识。孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而Morgan的基因学说则进一步将“性状”与“基因”相耦联，成为分子遗传学的奠基石。Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。在蛋白质化学方面，继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。

总结与分子生物学相关的诺贝尔奖。

三、分子生物学的主要研究内容 1． DNA重组技术------基因工程

基因工程指将不同DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。

DNA重组技术有着广阔的应用前景：

① 在生物技术制药领域中的应用。如：利用基因工程技术改造传统的制药工业；利用克隆的基因表达生产有用的肽类和蛋白质药物或疫苗。

②定向改造某些生物的基因组结构，使它们具备某些特殊的经济价值。③在基础研究中的应用。如：基因的克隆与分析；启动子分析。2．基因表达调控

因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。

原核生物的基因组和染色体结构都比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。

3．生物大分子结构功能----结构分子生物学

生物大分子的结构功能研究（又称结构分子生物学）一个生物大分子，无论是核酸、蛋白质或多糖，在发挥生物学功能时，必须具备两个前提:首先，它拥有特定的空间结构（三维结构）；其次，在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。

结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能相互关系的建立3个主要研究方向。最常见的研究三维结构及其运动规律的手段是X射线衍射的晶体学（又称蛋白质晶体学），其次是用二维核磁共振和多维核磁研究液相结构，也有人用电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法研究生物高分子的空间结构。

4．功能基因组学与生物信息学研究

先后完成了包括从大肠杆菌、酿酒酵母到线虫等十余种模式生物基因组全序列的测定工作，并于2002年2月12日完成人类基因组测序工作。世界两大最著名的学术刊物－nature和science同时发表了人类基因组全序列。

基因组测序工作的进展是非常令人振奋的。但是也随之产生了新问题。大

量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。因此读懂基因组称为后基因组时代的生命科学领域面临的巨大的挑战。

在功能基因组时代，应用生物信息学方法，高通量地注释基因组所有编码产物的生物学功能是一个重要的特征。生物信息学是在各种“组学”研究的推动下发展起来的.传统的研究方法是只研究某一个基因或蛋白质或转录产物，而“组学“的研究是采用高通量的技术分析细胞中全部的基因和蛋白质，这样势必会产生海量的信息，因此，人们必须寻求一种高速度、高效率、大规模的方式积累数据处理分析方法。

四、分子生物学展望 未来的发展方向：

不同模式生物基因调控网络的比较分析；RNA介导的基因表达调控网络；表观遗传（epigenetic）信息的整合；从数据整合到系统生物学（systems biology）。

第二章 遗传的物质基础－DNA 教学目的：使学生了解并掌握DNA的结构与功能

教学重点、难点：DNA的一级结构的测定，DNA的二级结构及超螺旋结构。课时安排：4学时 教学内容：

第一节DNA的一级结构 一、一级结构的构成

所谓DNA的一级结构，就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。核苷酸序列对DNA高级结构的形成有很大影响，如B-DNA中多聚（G-C）区易出现左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重复的DNA片段易出现发卡式结构等。

二、一级结构的序列测定

目前所用的DNA测序方法是在末端终止法的基础上发展起来的。由英国科学家Sanger提出的。Sanger在生物大分子的序列测定方面做出了杰出贡献。他曾在1953年利用小片段重迭法成功测定了胰岛素51个氨基酸序列，并获得诺贝尔奖。1977年又利用末端终止法测定了X174噬菌体得DNA序列，第二次获得诺贝尔奖。

末端终止法又称为双脱氧法，基本原理是模拟体内DNA的复制过程在体外合成DNA，通过测定DNA片段的相对长度来推断核苷酸序列。

至于成分大家不要死记，可以回忆一下DNA复制过程需要哪几种组分：模板、dNTP、引物、DNA聚合酶，其中一种dNTP的磷酸基团用P32标记。除此之外还需要每个管中分别加入一种ddNTP。DDNTP是双脱氧核苷酸，由于在3位上缺少-OH，无法与下一个单体之间形成磷酸二酯键，因此，一旦掺入DNA链的延伸后，便终止DNA的合成这样，在DNA聚合酶的作用下核苷酸链不断延伸，我们可以调整dNTP和ddNTP的浓度，使ddNTP在每个位置上都有一个掺入的机会。每个管都会产生一系列长短不一的DNA片段，其共同特征是末端的最后一个碱基是相同的。我们将所得的所有DNA片段进行凝胶电泳，长度不同，泳动的速度不同。8%-20%的聚丙烯酰胺可将相差一个碱基的DNA片段区

分开，由于dCTP是放射性标记的，我们将凝胶放射自显影后，有DNA片段的位置就会显示出相应的信号带。自下而上依次将碱基序列读出。

第二节DNA的二级结构 一、二级结构的特点

DNA不仅具有严格的化学组成，还具有特殊的高级结构，它主要以有规则的双螺旋形式存在，其基本特点是：

1、DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的；

2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧；

3、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。这就是嘌呤与嘧啶配对，而且腺嘌呤（A）只能与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）只能与胞嘧啶（C）配对。如一条链上某一碱基是C，另一条链上与它配对的碱基必定是G。碱基之间的这种一一对应的关系叫碱基互补配对原则。组成DNA分子的碱基虽然只有4种，它们的配对方式也只有A与T，C与G两种，但是，由于碱基可以任何顺序排列，构成了DNA分子的多样性。例如，某DNA分子的一条多核苷酸链有100个不同的碱基组成，它们的可能排列方式就是4100。

二、变性、复性及杂交

变性：指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，只涉及次级键的破坏。常用的DNA变性方法：热变性和用变性剂处理。

如何判断DNA是否发生变性了呢？常用的方法是测定DNA的光吸收值。在碱基的嘌呤环和嘧啶环中存在共扼双键，在240－290nm波长有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm。（蛋白质由于存在肽键，在280nm有明显的吸收峰）当DNA变性时，有序的碱基排列被破坏，光吸收值显著增加，该现象称为增色效应。当缓慢增加DNA溶液的温度时，记录不同温度下的A260的数值，即绘制成DNA的变性曲线。以温度为横坐标，以A260为纵坐标。当A260增加到最大值的一半时，这时的温度称为DNA的溶解温度或熔点，Tm表示。

除此之外，光吸收法也是实验室定量测定DNA和RNA浓度和纯度的一种方法。从某种样品中提取了基因组DNA，可根据A260/A280的比值判断其纯度。

复性：变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。

杂交：在退火条件下，带有互补核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的互补区段会形成双链结构。分子杂交是分子生物学常用的技术，可用来检测某一特定基因的时空表达情况和在基因组中的。

分子杂交最初是由Southern设计出来的。当时是用DNA探针检测的DNA，也就是DNA与DNA的杂交，人们就将这种方法称为是Southern blotting。在此基础上，人们设计出DNA探针检测RNA，称为Northern blotting。

基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern、northern）是一致的，都是探针和互补的靶基因结合，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片（DNA microarray）指将N个目的DNA用自动化设备点在固体支持物上，DNA经固化后，用不同颜色的荧光标记的探针对这些DNA同时进行杂交，根据杂交结果呈现的不同颜色，经计算机分析后得到关于N个基因表达情况的数据。

第三节DNA的高级结构

一、超螺旋结构及拓扑异构体

双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalently closed circle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)。有些单链环形染色体(如φ×174)或双链线形染色体(如噬菌体入)，在其生活周期的某一阶段，也必将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。

二、拓扑异构变化的生物学意义

DNA拓扑异构的变化是DNA的复制和转录过程所必须的。

一个闭合的DNA 分子可以用其连环数进行描述，连环数(Linking number)

是指一条链空间跨越另一条链的次数。顺序相同的闭合DNA 分子可能有不同的连环数，这反映了超螺旋程度的差异。连环数不同的相同DNA 分子称为拓扑异构体(Topological isomers)。

连环数由两个成分组成：缠绕数(Writhing number ,W)和扭转数(Twisting number, T)。扭转数T 是双链螺旋结构自身的一种性质，代表一条链绕另一条链旋转的双螺旋总圈数。它由每一圈配对的碱基数决定。对于平放在平面上的一个松弛的闭合环状DNA 来说，用碱基对的总数除以每一圈的碱基对数就是它的扭转数。

缠绕数W 代表双螺旋轴在空间上的弯曲，在直观上与超螺旋的概念相对应，但并非具有完全相同的数量上的定义或衡量。对于一个松弛分子，W=0 时连环数等于扭转数。我们经常用下面的公式计算连环数的变化量：

ΔL=ΔW+ΔT

第三章 染色体和基因

教学目的：使学生掌握基因组的概念、原核生物基因组的特点和真核生物染色体及基因组特点。

教学重点、难点：真核生物染色体的基本特征；卫星DNA及在分子标记中的应用；断裂基因；基因家族及串连重复基因簇。

课时安排：4学时 教学内容：

第一节基因组大小与C值矛盾

一、基因组概念

一个物种单倍体的染色体的数目，称为基因组。基因组中DNA 的总量是物种所特有的，称为C 值(C-value)。C 值的范围变化很大，从微生物中的<106 到一些植物和两栖类的>1011。图3.1 总结了进化中不同门类生物的C 值范围。随着复杂度增加，每组中最小基因组大小也会随着增加。

三、C值矛盾现象

单倍体基因组DNA 含量在低等真核生物中与形态复杂性有一定的正相关，但在高等真核生物中却非如此，它们的单倍体基因组DNA 含量变化不定。基因组大小与遗传复杂性并非线性相关，称为C 值矛盾(Paradox)。它涉及到真核基因组绝对和相对的DNA 数量。例如，蟾蜍Xenopus 和人类基因组大小差不多，但是人类遗传发育上更为复杂。在表面复杂程度相似的种属间(见图)也存在C 值矛盾，这个问题局限于一些种族内，昆虫、两栖和植物最为明显。在两栖中，最小的基因组<109bp，但是最大的基因组大约1011bp。这些两栖类间的差别似乎并不需要基因间这么大的差别，表明在大的基因组中有非编码DNA 的大量增加。目前我们并不清楚为什么自然选择允许这些DNA 的聚集(在其他种族中这种情况并不发生，基因组的分布是窄的。鸟类、爬虫类和哺乳类只允许小的偏差，其差异在基因组大小两倍范围之内)。

第二节原核生物染色体及基因

原核生物的DNA与稀疏的蛋白质结合，存在于类核体上，没有核膜包被。原核生物DNA分子小，基因排列紧密，空间利用率高。

1．功能上相关的几个结构基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点（启动子promoter、操纵子operator），在基因转录时协同动作，组成操纵元（operon）。介绍乳糖操纵元的结构、调控机制。2．绝大部分为编码基因，并通常以单拷贝形式存在。3．重叠基因

第三节真核生物的染色体

一、染色体的基本组成单位－核小体

真核生物的染色体(chromasome)在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。

核小体是构成染色质的基本结构单位，使得染色质中DNA、RNA和蛋白质组织成为一种致密的结构形式。核小体由核心颗粒(core particle)和连接区DNA(linker DNA)二部分组成，在电镜下可见其成捻珠状，前者包括组蛋白H2A，H2B，H3和H4各两分子构成的致密八聚体(又称核心组蛋白)，以及缠绕其上一又四分之三圈长度为146bp的DNA链；后者包括两相邻核心颗粒间约60bp的连接DNA和位于连接区DNA上的组蛋白H1(见图），连接区使染色质纤维获得弹性。核小体是DNA紧缩的第一阶段，在此基础上，DNA链进一步折叠成每圈六个核小体，直径30nm的纤维状结构，这种30nm纤维再扭曲成襻，许多襻环绕染色体骨架(Scaffold)形成棒状的染色体，最终压缩将近一万倍。这样，才使每个染色体中几厘米长(如人染色体的DNA分子平均长度为4cm)的DNA分子容纳在直径数微米(如人细胞核的直径为6－7μm)的细胞核中。

二、染色体的基本特征－端粒、着丝粒 1．着丝粒

在有丝分裂中，姊妹染色单位向细胞相反的两极移动。它们的运动依赖于染色体与微管(Microtubule)的接触，在另一端与极相连接(微管组成细胞的纤丝体系，在有丝分裂期间它们把染色体与细胞的极相连)。在微管端部的两个区域连接着微管组织中心(Microtubule organizing centers，MTOCs)，它位于染色体中心粒附近和两个极上。染色体上负责其在有丝分裂和减数分裂时分离的区域称为着丝粒

着丝粒的DNA顺序称为CEN顺序。CEN 区域中存在三种类型的序列元件(图)： CDE-Ⅰ是所有中心粒左侧边界变化很少的9bp 保守序列。CDE-Ⅱ是所有中心粒中都存在的A?T 比例大于90% 的80-90bp 长序列，其功能依赖于其长度而非准确序列，其成份是一些真核生物中短的随机重复(卫星)DNA 序列的遗迹，其碱基成分可能产生一些DNA 双螺旋结构上的特征性的弯曲。CDE-Ⅲ是所有中心粒右侧边界的11bp 长的高度保守序列，此类元件的两侧序列保守性较低，对于中心粒功能可能是必需的(CDE-Ⅲ在侧翼序列必需的情况下可能长于11bp)。2．端粒

通过断裂产生的染色体末端，会与其它染色体发生作用，然而天然染色体是稳定的，因此，染色体末端一定具有某种特殊结构，可以稳定染色体，该结构称为端粒。

我们可以用两个性质来定义端粒序列：必需存在于染色体的端部(或至少在线性DNA 分子的末端)；它必需赋予线性分子稳定性。

许多低等真核生物基因组中的线性DNA 分子，其端粒结构都是已知的。同样类型的序列也在植物和人类中发现，所以端粒的构建似乎遵循着普遍的规律。每个端粒由一系列短的随机重复序列组成。所有端粒序列能写成Cn(A/T)m 的一般形式，其中n>1 而m 为1-4 ；3端具有单链尾，且富含GT。

端粒一方面可保护线性DNA免受核酸酶攻击，另一方面，利用用从头合成的方式加入重复，能抵消在染色体端部无法复制所导致的重复丢失。

讨论端粒与寿命的关系。

第四节真核生物的基因

一、真核生物基因组中包含非重复序列和重复序列

1．重复序列 在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝，它占DNA总量的40%－80%。多为结构基因。

2．中度重复序列 这类重复序列的重复次数在10－104之间，占总DNA的10%－40%。各种rRNA、tRNA 及组蛋白基因等都属这一类。该类基因一般不编码。3．高度重复序列——卫星DNA 这类DNA只在真核生物中发现，占基因组的10%—60%，由6—100个碱基组成，在DNA链上串联重复几百万次。由于碱基 的组成不同，在CsCl密度梯度离心中易与其他DNA分开，形成含量较大的主峰及高度重复序列小峰，后者又称卫星区带（峰）。该类基因一般不转录。

小卫星和微卫星序列是由比卫星序列的重复序列单位更短的单位构成，其重复单位的长度分别为10~100bp和10bp，而重复序列单位的数目通常为5~50个，不同个体间重复序列单位数目变化很大。

在人类中小卫星位点是1－5kb的顺序，此顺序由长15-100nt的重复单位组成。当将人类的总DNA提出后，用限制性内切酶切成不同长度的片断（各种小卫星上都没有酶切位点），然后以小卫星DNA中的特异顺序为探针进行Southern杂交，可发现阳性片断的长度各不相同。由于不同个体的这种串联重复的数目和位置都不相同，所以小卫星DNA的Southern杂交带谱就具有高度的个体特异性，人们就称其为DNA指纹分析技术（DNA fingerprints）。

二、断裂基因

大多数真核生物的基因（包括编码蛋白质、rRNA、tRNA的基因）由间隔的外显子（表现在最终RNA产物中的序列）和内含子（从初始转录物中去除的序列）组成。

“一条基因，一种蛋白质”应修正为“一种蛋白质，一条基因”。因为一些DNA序列编码一种以上蛋白质。

三、基因家族与基因簇

真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样一组基因称为基因家族（gene family）。

同一基因家族的不同成员紧密排列在一起，称为基因簇（gene cluster）。但更多情况下是散布在不同染色体上。如：珠蛋白基因α、β、γ、δ。同一家族成员是由同一个祖先基因经过复制和变异传递下来的。

四、串连重复基因簇

串连重复基因出现在其产物被极度需要的情况下，如组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因。如：组蛋白基因，编码H1/H2A/H2B/H3/H4五种组蛋白的基因彼此靠近构成一个重复单位，这样的重复单位串连在一起。rRNA基因，真核生物中的5.8S/18S/28S rRNA（主体rRNA）基因组成重复单位，转录出一个45S

rRNA前体，然后通过转录后处理。此外，还有，tRNA基因也是串连重复排列，但各重复单位中的各tRNA可以不同。

五、假基因

基因组中因突变而失活的基因，它和同一家族的活跃基因在结构和DNA序列上有相似性。

第三章DNA复制

教学目的：使学生掌握DNA复制的机理及一般过程、复制的各阶段的主要生物学事件、复制的方式、复制的调控、DNA修复系统。

教学重点、难点：复制的机理；复制的起始；端粒的复制。课时安排：6学时 教学内容：

第一节DNA复制的机理及一般过程

一、半保留复制

半保留复制：Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。

1957年，梅塞尔和斯塔尔利用大肠杆菌（E．Coli）研究遗传物质DNA。在这项经典实验中，他们先将大肠杆菌放入只含有既氮15（氮14的同位素）的营养基中培养，然后将这些大肠杆菌转移到只含氮14的营养基中。提取不同培养代数细菌的DNA，用CsCl密度梯度离心。实验结果表明：在全部由15N标记的培养基中得到的15N-DNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是15N-DNA和14N-DNA的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N14N－DNA和14N14N-DNA。随着以后在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱，离心结束后，从管底到管口，CsCl溶液密度分布从高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在与其相当的CsCl密度处，在紫外光下可以看到DNA分子形成的区带。为了证实第一代杂交分子确实是一半15N-DNA－半14N－DNA，将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心，结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15N－DNA)及低密度带(14N－DNA)。它们的实验只有用半保留复制的理论才能得到圆满的解释。

二、半不连续复制

DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开

成单链时，一条是5'→3'方向，另一条是3'→5'方向。当以这两条链为模板时，新生链延伸方向一条为3'→5'，另一条为5'→3'。但生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化5'→3'延伸，这是一个矛盾。冈崎片段(Okaxaki fragments)的发现使这个矛盾得以解决。在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3'→5'，以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿5'→3'方向连续进行，这条链称为前导链(leading strand)。另一条模板链的方向为5'→'3'，以此为模板的DNA合成也是沿5'→3'方向进行，但与复制叉前进的方向相反，而且是分段，不连续合成的，这条链称为滞后链(lagging strand)，合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物是普遍存在的，称为DNA合成的半不连续复制。

第二节复制的过程

复制的过程总的说来包括起始、延伸和终止三个阶段。

一、复制的起始

1．复制的起始原点

很多实验都证明：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(originof replication)常用ori或O表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中，每个DNA分子只有一个复制起始点，因而只有一个复制子，而在真核生物中，DNA的复制是从许多起始点同时开始的，所以每个DNA分子上有许多个复制子。

DNA复制起始点有结构上的特殊性，例如：大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置，大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA，它的复制是典型的“ζ”型复制(由于形状像希腊字母ζ，见下图)。从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就停止。而有些生物的DNA复制起始区是一段富含A·T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起

始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。

2．复制的方向

3．DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质

解链酶：DNA开始复制时首先在起始点处解开双链，反应是在一种解链酶(helicase)的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。大肠杆菌中DnaB蛋白就有介链酶活性，与随从链的模板DNA结合，沿5'→3'方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3'→5'方向移动。解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。

单链结合蛋白质：它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。

DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由DnaB.DnaC和单链结合蛋白组成。

引物酶

是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3'-OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3'-OH末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。

二、DNA的延伸

由DNA聚合酶催化完成。1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ，(DNA polymerase Ⅰ,简写DNA polⅠ)后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，其中主要的复制酶是DNA聚合酶Ⅲ。当聚合酶的一个亚基连续合成先导链时，另一个亚基在模板链所形成的大单链环中，循环式起始、终止后随链上冈崎片段的合成。真核生物的NA聚合酶可分为复制所需的

酶如：α、δ、ε、γ和损伤修复所需的酶β、δ、ε、η、θ，其中，DNA聚合酶α起始DNA链的合成，DNA聚合酶δ延伸先导链，另一个DNA聚合酶δ或ε延伸后随链。DNA聚合酶γ负责线粒体DNA的复制。

真核生物线性DNA末端的端粒是怎样合成的呢？四膜虫抽提物中有一种酶，称端粒酶(Telomerase)，它使用端粒链的G+T 的3-OH 作为引物合成随机的TTGGGG 重复。此反应只需要dGTP 与dTTP。端粒酶是一个大的核糖核蛋白，它含有一个短RNA 组分，四膜虫中长159nt 而在Euplotes 中长192nt。每个RNA 都含有一个15-22nt 的序列和一个富含C 的重复序列的重复相同。这种RNA 为合成富含G 的重复序列提供模板。

三、复制的终止

当子链延伸达到terminus region（ter，带有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了。Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物（ter utilization substance）来完成的。

第三节 复制的方式

一、线状DNA的复制方式 1．中间起始：如前所述.2．末端起始：腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体，腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，其5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合（Rekosh et al., 1977），5’端上还具有末端反向重复序列（ITRs）。

在腺病毒的每个5末端都共价连接一个55Kda的蛋白质，该蛋白质称为末端蛋白质（terminal protein TP），以其丝氨酸羟基通过磷酸二酯键与5端的胞嘧啶共价连接。TPC核苷酸的自由末端3-OH通过DNA聚合酶引导延伸反应。这就产生了一条新链，其5‘末端与起始核苷酸C共价相连。

二、环状DNA的复制方式

1．复制：具有双链环状DNA分子的细菌和病毒所采用的复制方式。DNA在复制原点解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链，则出现两个叉子状的生长点，叫做复制叉，因此也称为复制叉式复制。可双向or单向，若是双向，可等速or不等速。

2．滚环复制：随后缺口产生的自由3’-OH末端被聚合酶延伸。新合成的链取代

原母链。

这种结构被称为滚环，因为延伸点围绕环形模板链滚动，形成一个多聚单链的尾巴。当这条链甩到一定程度时开始以半不连续的方式合成其互补链。

滚环复制在噬菌体中普遍存在。例如：噬菌体φX174含有单链环形DNA，称为正（+）链。在复制前首要合成其互补链即负（-）链，产生了双链环形DNA分子，以滚环方式复制。

噬菌体的基因组编码的A蛋白结合在复制原点，在正链上产生切断磷酸二酯键。切割后A蛋白仍然与5’末端相连，而3’末端则在DNA聚合酶的作用下延伸。SSB蛋白不断地结合到甩出的单链上，并改变其构型，趋向环化。当被置换链达到一个单位长度时，A蛋白可识别复制原点，将链切断，进一步将切下的单位的长度的DNA环化。A蛋白释放，开始另一循环。环化后被取代的正（＋）链可以作为模板合成互补负（—）链或被包裹到病毒体中。

另外，滚环复制为基因扩增提供了一种方式。见《分子遗传学》P109-110。3．D环复制：

真核生物线粒体DNA的复制方式。线粒体的H和L链上各有一个复制原点，在复制开始时，H链起始位点的复制像通常一样通过转录激活过程。RNA聚合酶转录出的RNA可作为引物，再由DNA聚合酶在引物的3’末端进行DNA聚合反应。随着链的延伸，新合成的L链取代了亲本L链，而产生一个替换环，称为D环。D环不断伸展，当伸展到环三分之二处时，被取代的L链上的复制起始点暴露出来，随后由特异的引发酶在该位点合成一段RNA引物，开始H链的复制。由于启动的延迟，当新L链合成结束时，新H链合成仅绕环三分之一圈。这样就释放出一个完整的双链环和一个开环结构。

第四节 复制的调控

一、原核生物复制的调控

原核生物复制的起始主要是由起始位点的甲基化状态来控制的。起始位点的A可被Dam甲基化酶所甲基化。在复制之前，起始位点的两条链都被甲基化，而复制后产生的DNA是半甲基化的。半甲基化的子链起始点只有在它们重新全部甲基化后才有起始功能。

二、真核生物复制的调控

在真核生物中，DNA的复制同样受到细胞周期的严格控制。在每一个起始点都需要执照因子来起始复制。执照因子是一种特殊的蛋白质，不能随意的穿越核膜。它在复制之前就已存在于细胞核中，一轮复制就会将这个因子失活或破坏。而细胞质中的执照因子也不能进入，因此DNA的复制不会被重复起始。只有在细胞发生有丝分裂期间，核膜发生破裂，执照因子才趁机进入核内，DNA的复制才可被起始。这样，就保证了复制的起始必须在经历整个细胞分裂过程之后才能重新发生。

第五节DNA的修复系统一、复制修复

1、错配修复系统：错配矫正酶、Pol Ⅰ、DNA连接酶

2、尿嘧啶糖基酶系统：尿嘧啶－N－糖基酶、AP内切酶、Pol Ⅰ、DNA连接酶

二、损伤修复

1、光复活：在可见光的活化之下由光复活酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成单体的过程。

2、切除修复：修复内切酶能识别引起DNA双螺旋变性的损伤，由UvrA、UvrB和UvrC三种亚基构成

3、重组修复：RecA具有催化DNA分子之间同源联会和交换单链的功能。

4、SOS修复：允许新生的DNA链越过TT二聚体而生长