第一篇：分子生物学教案

分子生物学教案

第一章 绪 论

本单元或章节的教学目的与要求

主要介绍分子生物学定义、研究内容和发展简史及未来发展方向等。授课主要内容及学时分配 2 学时 第一章 绪 论

1.分子生物学定义：是研究核酸等生物大分子的形态、结构、功能、及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世

界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

分子生物学主要研究核酸在细胞生命过程中的作用，包括核酸本身的复制、保存以及基因的表达与调控规律，所以，这门学科其实应该

叫做核酸生物学（biology of nucleic acid）。

2.生物学大事年表 1859 年达尔文出版《物种起源》，提出了自然选择原则。但他无法解释生物

为什么能将性状遗传给下一代。

1865 年孟德尔通过他的豌豆发现了统一规律和分离规律。（Gregor Mendel,1822-1884）: 遗传学的奠基人

1869 年米歇尔(Friedrich Miescher)分离出核酸。

1879 年弗莱明(Walter Flemming)发现染色体，并描述了细胞分裂过程中染色体的行为。1900 年孟德尔的成果被重新发现。

1903 年萨顿(Walter Sutton)发现染色体是成对的，并携带遗传信息。

1905 年加洛德(Archibald Garrod)提出了人类先天代谢疾病的概念，这是人类自身遗传研究的开始。

1911 年摩尔根(Thomas Hunt Morgan)提出基因学说，阐释基因在染色体上的分布，以及繁殖过程中染色体重组形成独特新个体的过程。

1913 年斯特提万特(Alfred Henry Sturtevant)绘制出第一张线式基因图谱。1928 年格里菲斯(Frederick Griffith)发现了一种可以在细菌之间转移的遗传分子。1929 年列文(Phoebus Levene)提出 DNA 的化学成分和基本结构。

1944 年 Oswald Avery, Colin Macleod 和 Maclyn McCarty 指出，Griffith 发现的遗传分子就是 DNA。

1948 年鲍林(Linus Pauling)提出蛋白质为螺旋形的理论。

1950 年查加夫(Edwin Chargaff)发现核酸中四种碱基的含量比例是一定的。1951 年富兰克林(Rosalind Franklin)拍摄到了核酸的 X 射线衍射照片。

1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒证实，传递遗传信息的是 DNA 而不是蛋白质。赫尔希也由于这一研究而荣获 1969 年的诺贝尔医学生理学奖。

1953 年沃森(James Watson)和克里克(Francis Crick)在《自然》杂志上发表 DNA 双螺旋结构的论文。J.Watson，美国冷泉港研

究所科学家； F.Crick，英国剑桥大学教授。1953 年他们创立了 DNA 的双螺旋结构模型，获得 1958 年诺贝尔奖。

1956 年 Joe Hin Tjio 和 Albert Levan Hereditas 确定人类共有 23 对染色体。Arthur Kornberg 分离出 DNA 聚合酶。

1957 年 Francis Crick 发表《论蛋白质合成》的演讲，提出 DNA 制造蛋白质的概念。1959 年 Jerome Lejeune 发现唐氏综合症（先

天愚型）是由于人体的第 21 对染色体变异造成的。唐氏综合征是人类最早发现的因染色体缺陷造成的疾病。

1960 年 Sydney Brenner, Francis Crick，Francois Jacob 和 Jaque Monod 发现信使 RNA(mRNA)。

1961 年 Francois Jacob 和 Jacques Monod 提出在分子水平上特定基因被激活或抑制的机制。J.Monod ； F.Jacob，法国科学家。由于他们提出了乳糖操纵子学说和在酶合成的遗传调控方面的重大贡献获得 1966 年诺贝尔奖。

1966 年 Marshall Nirenberg，Har Gobind Khorana 和 Robert Holley 阐明遗传密码。D.Baltimore ； H.Temin，美国科学家。由于他们各自发现了逆转录酶，打破了中心法则，该酶能使 mRNA 反转录成 cDNA，使真核基

因的克隆表达成为可能，为病毒学、遗传学、基因工程作出了重大贡献，他们获得 1965 年诺贝尔奖。

1967 年 Mary Weiss 和 Howard Green 使用体细胞杂合技术推进人类基因图谱绘制。1969 年 Jonathan Beckwith 分离出一个细菌基因。

1970 年 Hamilton O.Smith 发现了限制性内切酶，对核苷酸的排列顺序的研究及 DNA 重组技术的研究提供了帮助。

D.Nathans，美国霍普金斯大学医学院教授。由于他在限制性核酸内切酶方面的开创性成就获得 1978 年诺贝尔奖。

W.Arber，瑞士巴塞尔生物研究中心教授。1968 年他第一个指出了限制性核酸内切酶的存在并分离了 I 型酶 EcoB，获得了 1978 年 获诺贝尔奖。

H Smith，美国霍普金斯大学教授。1970 年他首次分离纯化了Ⅱ型限制性核酸内切酶 Hind Ⅱ，并阐明了其切点的专一性，为基因工

程的诞生奠定了基础，获得 1978 年诺贝尔奖。1972 年 Paul Berg 创造出第一个重组 DNA 分子。

1973 年 Herbert Boyer 和 Stanley Cohen 发展了重组 DNA 技术，发现改造后的 DNA 分子可在外来细胞中复制。

S.Cohen，美国斯坦福大学分子生物学教授。他在质粒的研究中作出了开创性的研究，1973 年他又第一个实现了细菌间抗药性基因的转移，创立了基因工程重组模式。科学界把这一年定为基因工程诞生之年，以纪念这位基 因工程的创始人。

1974 年美国发表 Belmont 报告，确立科研中进行人体实验的政策。

1975 年 Mary-Claire King 和和 Allan C.Wilson 发现，人类和猩猩的基因相似度达到 99%。1975 年 Georges Kohler 和 Cesar Milstein 开发出生产单克隆抗体的技术。

1977 年 Walter Gilbert，Allan M.Maxam 和 Frederick Sanger 开发出 DNA 测序技术。F.Sanger，英国剑桥大学教授。由于他在蛋白质一级结构和核酸序列分析方面的天才创造和震惊世界的成果，在 1958 年和 1980 年先

后两次获得诺贝尔奖。他是生物医学科学领域里唯一两次获得这一最高荣誉的人，是一位谦虚谨慎、沉默寡言的伟大科学家。

1978 年 David Botstein 开创核酸限制性片段长度多态性分析技术，用于标志不同个体间的基因差别。

1978 年美国开始借助基因技术用大肠杆菌批量生产人类胰岛素。

P.Berg，美国斯坦福大学化学教授。他首次用 SV40 作载体与λ噬菌体实现了两种病毒 DNA 的重组。由于他在重组 DNA 技术方面的功 绩获得 1980 年诺贝尔奖。

H.Boyer，美国加州大学生化教授，美国基因工程公司董事长。1977 年，他首次用细菌合成生长激素释放抑制素，是基因工程第一块

金牌的获得者。接着，1980 年，他又与华盛顿大学的学者合作，用酵母生产了人干扰素。他筹建了美国基因工程公司，是基因工程研 究中的权威科学家。

1982 年 GeneBank 数据库建立。

W.Gilbert，美国哈佛大学教授。他与瑞士苏黎世大学和生物基因 公司 教授 Weissmann 合作，用细菌生产了人干扰素。W.Gilbert 也是测定 DNA 序列的化学直读法创始人。由于他对科学的巨大贡献，获 1980 年诺贝尔奖。1983 年 Kary Mullis 发展聚合酶链式反应（PCR）技术

1983 年辩认出与亨廷顿氏症有关的基因，这是科学家发现的第一个人类疾病基因。

1984 年 Alec Jeffreys 发明了基因指纹技术，可以用人的头发、血液和精液等来鉴定身份。1984 年关于人类基因组测序的第一次公开讨论开始。1986 年 Leroy Hood 开发自动测序机。1988 年人类基因组组织(HUGO)成立。

1990 年美国正式启动人类基因组计划。随后，德国、日本、英国、法国和中国也相继加入该计划。1991 年 Craig Venter 开发出新的测序技术。1994 年美国一公司推出新的转基因西红柿罐头，其保质期比普通西红柿更长，成为人类历史上第一个转基因食品。

1995 年 7 月，美国人类基因组研究所绘出了流感嗜血杆菌的基因图谱； 3 个月后，科学家又绘制出了生殖器支原体的基因图谱。1996 酵母基因组测序完成。

1997 年苏格兰罗斯林研究所培育出世界上第一例体细胞克隆动物绵羊“多莉”。1997 年大肠杆菌基因组测序完成。

1997 年参加人类基因组计划的科学家决定将研究成果无偿向全世界公开。1998 年结核性分枝杆菌以及梅毒螺旋体基因组测序完成。线虫基因组测序完成。

日本科学家用一头成年牛的体细胞克隆出 8 头克隆牛犊。

1999 年人类第 22 号染色体测序完成，这是第一个完成测序的人类染色体。2000 年果蝇和拟南芥的基因组测序完成。

Craig Venter 和 Celera 公司和人类基因组计划相继宣布，人类基因组草图完成。2001 年 Craig Venter 公布了绘制人类蛋白质组图谱的计划。2002 年水稻、小鼠、疟原虫和按蚊基因组测序完成

2003 年人类基因组计划宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。3.DNA 的发现

首先，40 年代发现了生物的遗传物质是 DNA。Avery 在美国 1934 年的一次学术会议上，首次报导了肺炎球菌(Djprococcus pneumonas)的转化。超越时代的科学成就往往不容易很快被人们接受，Avery 成就的命运也是一样，当时并没有引起阵阵掌声。事隔 年，他的论文才公开发表； Avery 的工作意义深远，他不仅证明 DNA 是遗传物质、还证明 DNA 可以把一个细菌的性状转给另一个

细菌，理论意义十分重大。正如诺贝尔奖金获得者 Lederberg 指出的，Avery 的工作是现代生物学科学性的革命开端、也可以说是基 因工程的先导。

早在 1928 年，Griffith 等人就发现，肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。细菌的毒力（致病力）是由细胞表面夹膜中的多糖

所决定的。具有光滑外表的 S 型肺炎链球菌因为带有夹膜多糖而能使小鼠发病，具有粗糙外表的 R 型细菌因为没有夹膜多糖而失去致 病力。

Avery 用实验方法证实了 Griffith 的发现。Avery 第一个用实验方法证明了基因就是 DNA 分子。其次，50 年代搞清了生物遗传物

质的分子机制。1953 年，Watson 利 Crick 提出了 DNA 结构的双螺旋模型。这一成就对于生命科学的发展，作出了可与达尔文学说 媲美、与孟德尔定律齐名的贡献。

1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒证实，传递遗传信息的是 DNA 而不是蛋白质。

美国冷泉港卡内基遗传学实验室的科学家 Hershey 和他的学生 Chase 在 1952 年从事噬菌体侵染细菌的实验。噬菌体专门寄生在细菌 体内。噬菌体感染细菌时，1）先是其尾部吸附在细菌表面；）随后像注射器那样由尾部将头部的 DNA 注入细菌体内，蛋白质外壳并不侵入； 3）进入菌的 DNA 借助宿主细菌的原料和能量，合成噬菌体自身的 DNA 和蛋白质； 4）新合成的 DNA 和蛋白质外壳，能组装成许许多多与亲代完全相同的子代噬菌体； 5）细菌细胞因噬菌体的大量增殖而破裂，结果释放出几十甚至几百个既有蛋白质外壳又有头部 DNA 的完整结构的噬菌体。

第三，60 年代确定了遗传信息的传递方式。从 1961 年开始，以 Nirenberg 等为代表的一批科学家，经过不倦的努力，确定遗传信息

是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一种氨基酸。

到 1966 年全部破译了 64 个密码，编排了一个震惊世界的密码字典，阐述了中心法则，提出的遗传信息流是 DNA → RNA →蛋白质。

从此，千百年来使人迷惑不解的种瓜得瓜、种豆得豆的遗传现象，在分子水平上得到了合理解释。

4.分子生物学的研究内容： 1）DNA 重组技术 2）基因表达调控研究 3）生物大分子的结构功能研究）基因组、功能基因组与生物信息学研究

4.1 DNA 重组技术 DNA 重组技术（又称基因工程），它是将不同的 DNA 片段（某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起

来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格地说，DNA 重组技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改进的体系。

DNA 重组技术有着广阔的应用前景）可用于大量生产某些正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类及抗体等，提高产量，降低成本，使许多有价值的多 肽类物质得到广泛应用。）可用于定向改造某些生物的基因结构，使它们所具备的特殊经济价值得到成百上千倍地提高。如用在分解石油、生产避孕疫苗及在 实验室生产蜘蛛丝等。）可用于基础研究。如对启动子的研究、增强子及对转录因子的克隆与分析的研究等。4.2 基因表达调控研究

蛋白质分子参与被控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是 DNA）分子编码，表现为特定的

核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。

在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境控制）

基因表达的调控主要发生在转录水平和翻译水平上。原核生物的基因组和染色体结构比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平上。

真核生物有细胞核结构，转录和翻译在时间和空间上是分开进行的，并且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控 可以发生在各种不同的水平上。

基因表达调控主要表现在信号转导研究、转录因子研究及 RNA 剪接 3 个方面。

信号传导是指外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激活诸如离子通透性、细胞形状或其它细胞功能方面的应答过程。

当信号分子（配体）与相应的受体作用后，可以引发受体分子的构型变化，使之形成专一性的离子通道，也可以引发受体分子的蛋白激

酶或磷酸酯酶活性，还可以通过受体分子指导合成 cGMP、cAMP、肌醇三磷酸等第二信使分子。信号传导引起细胞功能的改变，主要是由于信号最后活化了某些蛋白质分子，使之发生构型变化，从而直接作用于靶位点，打开或关闭 某些基因。

转录因子是一群能与基因 5 '端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

在对植物的某些性状进行遗传分析时发现，某些基因的突变会影响其它基因的表达。例如，有 20 多个基因参与玉米花青素的生物合成，但其中的 Cl、r、pl、或 b 基因发生突变后，则这个代谢途径中的结构酶基 因全部被关闭。

真核基因在结构上的不连续性是近10 年来生物学上的重大发现之一。当基因转录成 pre-mRNA 后，在 5 '端加帽，3 '端加 poly（A），还要切去内含子，使外显子（编码区）相连后成为成熟 mRNA。

研究发现，许多基因中的内含子并不是一次全部切去，而是在不同的细胞或不同的发育阶段选择性剪切其中部分内含子，生成不同的 mRNA 及蛋白质分子。

RNA 选择性剪切是真核基因表达调控中一种比较灵活的方式。4.3 生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学

一个生物大分子，包括核酸、蛋白质、多糖，具有生物活性的条件有两个： 1）具有特定的空间结构（三维结构）；）在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。

结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。

它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能间的相互关系 3 个主要研究方向。4.4 基因组、功能基因组与生物信息学

2001 年 2 月，Nature 和 Science 同时发表了人类基因组全序列，是人类历史上最伟大的成就之一。

现已有数十种原核生物、酵母、果蝇、拟南芥等真核生物的基因组基本被破译了，为人类认识自然、改造自然打下了坚实的基础。

测定基因组序列是了解基因的第一步，只有知道了基因所编码的蛋白质的功能和活性，才能指导人们利用这些基因产物。

于是，又提出了“蛋白组”计划（又称“后基因组计划”或“功能基因组计划”）, 目的是快速、高效、大规模鉴定基因的产物和功

能。基因组信息量庞大，如人细胞中携带 29 亿多个碱基对。

依靠计算机快速高效运算并进行统计分类和结构功能预测的生物信息学相应诞生了。有了生物信息学知识，人们可以最大限度地开发和运用基因组学所产生的庞大数据。5.分子生物学展望）绵羊多利是核转移克隆技术的第一次大的成功。在这一技术中，一个细胞的 DNA 被转移到失去自身遗传物质的空的卵细胞中。然

后，卵细胞在转移 DNA 的控制下进行发育。成为克隆技术发展的一个里程碑。）Kind 的研究组在牛和猪的细胞中成功地使用了基因打靶技术的技术，并称他们计划培育“敲除”猪----这种猪将携带的一种

蛋白质来帮助人体免疫系统接受移植的猪器官。3）人类基因组计划与生物制药产业发展前景。

———人类基因组计划（HGP）是人类科学史上的伟大工程，人类基因组序列的“工作框架图”的绘就，是该计划实施进程中的一个重

要里程碑；——— HGP 从整体上解决肿瘤等疾病的分子遗传学问题，6 千多种单基因遗传病和多种多基因疾病的致病基因和相关基因 的定位、克隆和功能鉴定是 HGP 的核心部分，它将彻底改变传统新药开发的模式，并赋予基因技术的商业价值；

——— HGP 将进一步深化生物制药的产业结构，引发基因诊断、基因疫苗、基因治疗、基因芯片等新兴产业；

——— HGP 完成后，人类基因序列将全部输入公共基因数据库，使我国的制药工业在一个新的起点上与国外制药企业展开竞争，从我国自主克隆的人类基因和公共数据库的人类基因中开发出具有自主知识产权的基因组药物，成为我国生物制药摆脱困境的有效途径；

———国内上市公司已进军基因技术的相关产业，但尚处于初级阶段，HGP 是国内生物制药公司进行企业模式调整的重要契机，未来生

物制药公司的竞争力主要取决于推出自主知识产权新药的速度、数量和质量。）人类基因组学的前途有关基因组的大量知识将扩大我们对生物学过程的认识，并带来可评价患病危险性的新诊断手段，创立个人化

医疗学。基因组信息的利用会增进对生物学过程的了解而变革生命科学，使科学家可以针对着影响健康和疾病的具体过程。

获得利益的商业领域有药物发现和开发、医学诊断、农业，等等。

影响新药开发的一个最重要的因素是可以用于开发新药的已知目标分子数量有限。疾病目标分子可以受一种药物影响并在人体内引起后

续的所希望的生物学反应。历史上，发现新目标分子的过程极慢，极费钱，因为它依赖于做出发现的试验和纠正方法。基因组学研究将

使药物设计人员直接针对有利害关系的分子，所以减少上述依赖。这样不仅是生产出新的更好的药物，而且缩短新药上市周期，并降低 成本。

由于药物的严重副作用，美国每年有 220 万人入院，因这些副作用而死亡者超过 10 万人。已有具体器官对药物的基因表达分布图，研

究人员可以更精确地研究新药化合物的毒性。此外，基因表达数据与代谢途径多态性信息结合起来，将为个别患者对不同剂量的反应方

式提供重要指标，因而明显减少治疗中产生的意外副作用。

受人类基因组数据影响的另一领域是制药基因组学。这个学科的重点是找出患者内可能影响药疗功效即个人对一具体药物的吸收与代谢 的遗传变异，发展更加个人化的药物疗法。因为越来越多的证据说明，某一药物并非对所有的人有同样的作用，所以制药基因组学对于

制药和生物技术界来说已变得非常重要，以致几乎所有制药公司都在成立制药基因组学机构。以基因组学为基础的新治疗学将集中确定

某个人患某一种病的危险性，而留意该患者的具体基因以及与疾病相关的任何变化。这些新诊断手段可能对一患者患一具体病症的潜在

危险性做出更准确评价，给予更好的预防性治疗。

农业是可能得益于基因组学研究的另一领域。对动植物疾病进行诊断并针对那些疾病发展处治方法的能力，应能使农产品品质改善，产

量提高。例如，来自疾病的遗传信息的比较或抗虫害植物品系和不抗虫品质的对比以及选育计划中有利试验的运用，将使可在世界各个

不同农业区种植的新品系数量和成功率明显增加。这样不仅会增加食物数量，也提高其营养质量。5）基因疗法的典型例子是半乳糖血症病人的基因治疗。这种病人由于细胞内缺少基因 G，不能产生半乳糖-1-磷酸干扰素基因，每 106 个细胞能生产干扰素 5x106 单位，并且 95 ％分泌至细胞外。

1985 年，美国加州大学 Maeda 用杆状病毒作载体，家蚕作表达系统，合成α干扰素基因在家蚕细胞及家蚕中的高表达”研究。他们用 PCR 技术从人染色体中扩增出了 566bp α 1-干扰素基因，用

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移载体 pBF5 介导，在多角体基因强启动子驱动下，分别在家蚕细胞和虫体中实现了高效表达。采用微

载体 Cytodex3 高密度培养家蚕细胞(10L 规模)，α 1-干扰素效价达到 6.4x106 单位／ m1 ；当用重组病毒注射感染 5 龄家蚕

时(3 万条虫规模)，表达效价平均达到 1x107 单位／条蚕。

α模板-dNMP 高能复合物。DNA 聚

合酶具有对此复合物核对的能力，看掺入的核苷酸是否正确。这个核苷酸（dNMP）这时可能被释放的机会远远高于正确核苷酸。这 就是动力学校对模型。）DNA 聚合酶具有聚合酶活性，还具有 5 ' → 3 ' 和 3 ' → 5 ' 的外切酶活性。DNA 聚合酶的 3 ' → 5 ' 外切酶活性可以

随时将已经掺入的错配的脱氧核糖核苷酸从生长的多核苷酸链上去除，保证了 DNA 复制的忠实性和准确性。

1.DNA 的半保留复制机理

DNA 的复制是分别以亲代 DNA 链为模板合成两条子代 DNA 链；在子代 DNA 双链中，一条是新合成的，一条是亲代的，称为 DNA 的半保留复制。

2.3.2 复制的起点、方向和速度

复制时，双链 DNA 要解开两股链分别进行，所以这个复制起点呈现叉子的形式 , 称为复制叉。复制子（replicon）定义： DNA 分子上一个独立的复制单位。一个复制子只含有一个复制起点（origin,ori）。

通常，细菌、病毒和线粒体的 DNA 分子都是作为单个复制子完成复制的，而真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制。

复制叉以 DNA 分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。一个复制原点连接到任一 DNA 分子上都支持其复制的能力。复

制原点一般由 A-T 丰富区组成。在真核细胞中，DNA 的复制属于细胞周期的一部分。细菌中，DNA 复制与细胞生长相协调。首先是

复制周期的起始频率被调整到与细胞生长 的速率相适应，其次是复制周期的完成与细胞分裂相联系。2.3.3 复制的几种主要方式 2.3.3.1 线性 DNA 双链的复制线性 DNA 先

在 ori 处形成复制眼，从复制眼开始可以单向或双向复制，真核生物都是多复制眼起始的双向复制。2.3.3.2 环状 DNA 双链的复制 1）θ型复制

环形 DNA 大多采用θ型复制，如 E.coli。

特点：从原点 ori 开始，通常采用双向等速复制，不断扩大复制泡，形成θ环。2）滚环型复制（rollingcircle）

某些环形的病毒 DNA，如θ x174、λ噬菌体都是以这种方式复制。这是一种单向复制类型。）D 环复制双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的 单链环（D-环）。

2.4 原核生物和真核生物 DNA 的复制特点 2.4.1 原核生物 DNA 的复制特点 2.4.1.1DNA 双螺旋的解旋

DNA 复制时，双链首先解开，形成复制叉

复制叉的形成过程有多种酶和蛋白质参与。将主要的酶和蛋白质介绍如下。1）单链结合蛋白（SSB 蛋白）SSB 蛋白可牢固地结合在单链 DNA 上，在原核生物中表现出协同效应，如第一个 SSB 蛋白结合到

DNA 上去的能力为 1，第二个 SSB 蛋白结合能力则高达 103。SSB 蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单

链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环。所以，SSB 蛋白只保持单链的存在，并不起解链的作用。

SSB 没有催化功能，它可以特异性地结合在单链区，使之免被核酸酶水解，起到保护和维持单链的作用。2）DNA 解链酶（DNAhelicase）

用于把 DNA 双链解开形成单链。具有 ATPase 活性，利用水解 ATP 释放的能量，催化双链 DNA 解链。大部分 DNA 解链酶（包括大肠

杆菌解链酶 II、III、T4 噬菌体 dda 基因、T4 基因 41 和人解链酶等）可沿滞后链模板的 5 '→ 3 '方向并随着复制叉的前进

而移动，只有另一种解链（Rep 蛋白）是沿前导链模板的 3 '→ 5 '方向移动。因此推测 Rep 蛋白和特定 DNA 解链酶分别在 DNA 的

两条母链上协同作用，以解开双链 DNA。

DNA 的解链过程，首先是在拓扑异构酶 I 的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。

参与解链的除一组解链酶外，还有 DNA 蛋白等。

一旦局部解开双链，就必须有 SSB 蛋白来稳定解开的单链，以保证局部结构不会恢复成双链。接着，由引发酶组成的引发体迅速作用

于两条单链 DNA 上。不论是前导链还是滞后链，都需要一段 RNA 引物以开始子链 DNA 的合成 2.4.1.2 冈崎片段与半不连续复制在

DNA 的复制过程中，前导链是连续复制的，而滞后链是通过冈崎片段的连接来合成的，是不连续的，称之为 DNA 的半不连续复制。所有

DNA 聚合酶的方向都是 5 '→ 3 '，而不是 3 '→ 5 '。为了解释 3 '→ 5 '是如何合成滞后链的，冈崎提出了 DNA 的半不连续复制。

现在已知，一般原核生物的冈崎片段要长些，真核生物中的要短些。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性 的，因而称之为 DNA 的半不连续复制。2.4.1.3 复制的引发和终止

复制起始时发生的事件：①双链 DNA 在一个很小的区域内打开，这是 oriC 区域特有的；②由解旋酶催化，开始解螺旋，并持续进行

下去；③形成引物，第一个核苷酸装配到引物上；这些事件对前导链只发生一次，而后滞链上每次开始合成冈崎片段时都要发生。

目前已知的 DNA 聚合酶都只能延长已存在的 DNA 链，而不能从头合成 DNA 链。

研究发现，DNA 复制时，往往先由 RNA 聚合酶在 DNA 模板上合成一段 RNA 引物，再由 DNA 聚合酶从 RNA 引物 3 '端开始合成新的

DNA 链。对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段 RNA 引物，DNA 聚合酶就能以此为起点一直合成下去。但对于滞后链

来说，引发过程就十分复杂，需要多种蛋白质和酶的协同作用，还牵涉到冈崎片段的形成和连接。滞后链的引发过程：

引发体：后滞链的引发过程往往由引发体（primosome）来完成。先是由 6 种蛋白： n,n ' ,n '' ,dnaB,C 和 I 构成引发前体，而

后与引发酶（primase）结合进一步组装成引发体。

引发体像火车头一样在滞后链分叉的方向上前进，并在模板上断断续续地引发生成滞后链的引物 RNA 短链，再由 DNA 聚合酶 III 作

用合成 DNA，直到遇到下一个引物或冈崎片段为止。由 RNaseH 降解 RNA 引物，并由 DNA 聚合酶 I 将缺口补齐，再由 DNA 连接酶

将两个冈崎片段连在一起形成大分子 DNA。总结

前导链的连续合成和后滞链的不连续合成

a.旋转酶（topoII）改变双螺旋的构象，解螺旋酶解开双链。b.SSB 结合到解开的单链上。c.引发体合成 RNA 引物。d.DNA 聚合酶Ⅲ作用下合成先导链。e.滞后链开始合成，形成第一个冈崎片段。f.复制叉继续前进，前导链连续合成，滞后链上合成新 的 RNA 引物。g.第二个冈崎片段形成，DNA 聚合酶Ⅰ切去引物，并加上脱氧核苷三磷酸。h.间隙被 DNA 连接酶封闭。链的终止

除 Tus 蛋白以外，链的终止看起来不需要太多的蛋白质参与。当复制叉前移，遇到 20bp 重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus 复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在 DNA 拓扑异构酶 IV 的作用下使复制叉解体，释放子链（图 2-23）。2.4.1.4DNA 聚合酶

现已发现在大肠杆菌中存在 DNA 聚合酶 I、II、III。

1)DNA 聚合酶Ⅰ主要负责 DNA 损伤的修复和冈崎片段之间间隙的填补。用枯草杆菌蛋白酶处理 DNA 聚合酶Ⅰ可得两个片段，大片段

分子量 76kd，被叫作 klenow 片段，广泛用于 DNA 序列分析中。

① 5' → 3' 聚合活性要求有双链 DNA 模板和具有 3' 羟基的引物，活性很高，可达 1000 核苷酸 /min。② 3' → 5' 外切活性可

以对不配对的局部单链进行识别，切除不配对碱基，又称“校正功能”。③ 5' → 3' 外切活性主要功能是切除复制过程中的引物。

pol Ⅰ的 5' → 3' 外切活性有三个特点： a.必须有 5'-P 末端。b.被切除的核苷酸必须是氢键配对的。c.可以切除脱氧核糖

核苷酸，也可以切除核糖核苷酸。此酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着重要作用。它也可用以除去冈崎片段 5 '端 RNA 引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将此片段连接起来。DNA 聚合酶 II 是一条 120kD 的肽链，催化 5 '→ 3 '方

向合成 DNA，也具有 3 '→ 5 '外切酶活性但没有 5 '→ 3 '外切酶活性。可能在当细胞 DNA 受到化学或物理损伤时，DNA 聚合酶 II 在修复过程中起特殊作用。DNA 聚合酶Ⅲ pol Ⅲ是体内 DNA 复制的主要承担者，是复制的主要酶类。全酶由多亚基

组成，至少有 10 种，共 22 个亚基：α 2 ε 2 θ 2 δ 2 γ 2 η 2 δ '2 χ 2 θ 2 β 2 其中α、ε、θ三种亚基组成核心酶，其它为辅助蛋白。

rRNA 的功能与蛋白质生物合成相关，可分别与 mRNA、tRNA 作用，催化肽键的形成。引物酶和 RNA 聚合酶引物酶：用于合成引物 的酶。利福平：抑制 RNA 的转录，使细菌无法繁殖。用利福平处理发现：先导链不能合成，而后随链能合成。

解螺旋酶用于把 DNA 双链解开形成单链。具有 ATPase 活性，利用水解 ATP 释放的能量，催化双链 DNA 解链。

2.4.2 真核生物 DNA 的复制特点

真核生物 DNA 的复制与原核生物 DNA 的复制有很多不同。真核生物每条染色体上可以有多处复制起点，而原核生物只有一个起始点。

真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起点上 DNA 的复制不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起点上可以连续开始

新的 DNA 复制，表现为虽只有一个复制单元，但可有多个复制叉。真核生物 DNA 的复制子称为 ARS（autonomouslyreplicatingsequences），长约 150bp 左右，包括数个复制起始必需的保守区。真核生物 DNA 复制的起始需

要起始原点识别复合物（ORC）参与。真核生物 DNA 复制叉的移动速度大约只有 50bp/s，还不到大肠杆菌的 1/20，因此，人类

DNA 中每隔 3000 ～ 300000bp 就有一个复制起始位点。真核生物 DNA 复制必需的成份 1.染色体 DNA 复制必需三种核苷酸序列①复制起点②着丝粒③端粒。2.RNA 引物(RNAPrimer)，一般 8 ～ 14nt，带游离 3'-OH 末端。

3.参加 DNA 复制的主要酶和蛋白质。① DNA 聚合酶(DNAPolymerase)真核 DNA 复制的主要酶 DNAPola/ δ。功能 : 从 5' → 3'

方向延伸与模板互补的子代链。②引发酶(Primase)与其他多种蛋白组成多蛋白复合体-引发体(Primosome)，催化 RNA 引物合成

和复制起始。③ DNA 连接酶(DNALigase)，催化一个双链 DNA 的 5 ' 磷酸与另一双链 DNA 的 3 '-OH 形成磷酸二酯键。④ DNA

解链酶(DNAHelicase), 打开 DNA 双链。⑤增殖细胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)，辅助催化前导链合成。

⑥端粒酶(Telomerase)末端复制问题。端粒酶负责染色体末端(端粒)复制 , 是由 RNA 和蛋白质组成的核糖核蛋白。其中的 RNA 成分是端粒复制的模板(因此端粒是逆转录酶)。作用 : 维持端粒长度。端粒酶活性可用基于 PCR 的“ TRAP ”（Telomeraserepeatamplificationprotocol）法测定（Kim,Netal.,science,266,2011-2014(1994)端粒与细胞寿命。端粒、端

粒酶与肿瘤的关系：绝大多数恶性肿瘤具有端粒酶活性但端粒缩短，但也有约 5% 的肿瘤无端粒酶活性且端粒较长。

端粒酶作为新的肿瘤标志和肿瘤治疗靶点。

真核生物中发现有 5 种 DNA 聚合酶，分别是：α、β、γ、δ、ε。

⑴ DNA 聚合酶α是 DNA 复制的主要酶类，由 4 个亚基组成。原因是：①所有强烈抑制α酶的抑制剂都能抑制细胞的复制。②α酶的

温度敏感突变株使该细胞的 DNA 复制成呈温度敏感型。③显微注射α酶的抗体可以抑制 DNA 的复制。④α酶的活性随细胞周期而变化，S 期活性最高。⑵ DNA 聚合酶δ具有 3 '→ 5 '外切酶活性，对于复制的真实性十分重要。同是也是前导链合成的主要酶类。聚合 酶γ负责线粒体基因组的复制。

目前认为：α酶和δ酶都是真核 DNA 复制酶。δ酶在复制中合成前导链，α酶合成后滞链。δ和ε都具有 3 ‘→ 5 '外切核酸酶的

活性，说明二者都有校对功能。δ和ε之间的差别是：在催化持续的 DNA 合成时，δ需要一个辅助蛋白因子－－增值细胞核抗原

（proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）, 而ε则不需要。β可能主要在 DNA 损伤的修复中起作用。ε的主要功能可能是在 去掉 RNA 引物后把缺口补全。2.4.3 DNA 复制的调控

原核细胞的生长和增殖速度取决于培养条件，但在生长、增殖速度不同的细胞中，DNA 链延伸的速度几乎是恒定的，只是复制叉的数 量不同。

迅速分裂的细胞具有较多复制叉，而分离缓慢的细胞复制叉较少并出现复制的间隙。细胞内复制叉的多少决定了复制起始频率的高低，这可能是原核细胞复制的调控机制。复制起始频率的直接调控因子是蛋白质和 RNA。2.4.3.1 大肠杆菌染色体 DNA 的复制调控 原核生物 DNA 链的延伸速度是恒定的。与生长、增殖相配合协调的 DNA 的合成，主要依靠复制叉数量的不同。迅速分裂的细胞具有

较多的复制叉，分裂缓慢的细胞复制较细胞复制叉的多少取决于复制起始的频率，这是原核细胞复制的调控点。复制子的调控由复制

起始因子和起始位点两部分组成。E.coli 的起始位点主要是 oriC，与蛋白相互作用来启动复制。主要的起始因子有 dnaA、dnaH 等蛋白质，它们通过与始位点形成复合物相互作用，确定复制的起始频率。研究发现： dnaA 对复制起正调控作用。

2.4.3.2ColE1 质粒 DNA 的复制

ColE1DNA 复制不依赖于其本身编码的蛋白质，而完全依靠宿主 DNA 聚合酶。质粒 DNA 编码两个负调控因子 Rop 蛋白和反义 RNA（RNA1），它们控制了起始 DNA 复制所必须的引物合成.细胞内 RNA1 的浓度决定了 ColE1 质粒的复制起始频率。Rop 蛋白能

提高 RNA1 与引物前体的相互作用，从而加强了 RNA1 的负调控作用。（图 2-24）

2.4.3.3 真核细胞 DNA 复制的调控真核细胞中 DNA 复制有三个调控点：①细胞生活周期水平的调控 也称为限制点调控，即决定细胞停留在 G1 还是进入 S 期。许多外部因素和细胞因子参与限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂、外科

切除、细胞质因子等可诱发 G1 进入 S 期。②染色体水平的调控

决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在 S 期起始复制，这种有序复制的机理还不清楚。

③复制子水平的调控。

决定复制的起始与否。这种调控从单细胞生物到高等生物是高